熒光壽命成像顯微術(shù)(FLIM)是一種利用熒光染料固有特性的成像技術(shù)。除了具有特有的發(fā)射光譜外，每個(gè)熒光分子還有特有的壽命，它反映了熒光基團(tuán)在發(fā)射光子之前處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間。除了標(biāo)準(zhǔn)的熒光強(qiáng)度測(cè)量外，壽命分析還可以提供其他信息。過(guò)去，壽命成像一直是一種緩慢、復(fù)雜的專(zhuān)業(yè)化技術(shù)。只有經(jīng)驗(yàn)豐富的顯微鏡**或物理學(xué)家才會(huì)使用這種技術(shù)。熒光壽命成像提供了額外的信息，有助提高共聚焦成像的質(zhì)量。它非常適合用于區(qū)分熒光發(fā)射光譜重疊的熒光探針，或消除不需要的背景熒光信號(hào)。熒光壽命(FLT)是熒光團(tuán)在發(fā)射光子并返回基態(tài)之前花費(fèi)在激發(fā)態(tài)的時(shí)間。湖北紅外熒光壽命成像報(bào)價(jià)

門(mén)控探測(cè)法適用于單組分熒光強(qiáng)度衰減的測(cè)量和熒光壽命成像。熒光壽命可通過(guò)在兩個(gè)不同延遲時(shí)刻開(kāi)啟的相同寬度的門(mén)內(nèi)記錄的熒光強(qiáng)度信息求得，通常情形下，在條件允許的情況下，采用多門(mén)控探測(cè)，即選取多個(gè)窗口獲取多幅圖像（通常為5~10幅）來(lái)反演壽命圖像。一般使用門(mén)控微通道板像增強(qiáng)器（MCP Intensifier）或者增強(qiáng)型CCD（Intensified CCD）相機(jī)，實(shí)現(xiàn)樣品的寬場(chǎng)（full-field）熒光壽命成像。通過(guò)在樣品受到超短光脈沖激發(fā)后的不同時(shí)刻（時(shí)間窗口）選通像增強(qiáng)器或CCD相機(jī)，獲得一組熒光強(qiáng)度圖像，然后利用公式，逐點(diǎn)計(jì)算出樣品上各點(diǎn)的熒光壽命并成像。湖北紅外熒光壽命成像報(bào)價(jià)由于熒光壽命成像不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術(shù)無(wú)法代替的優(yōu)異性能。

熒光壽命可以在頻域或者時(shí)間域測(cè)量。時(shí)間域測(cè)量方法涉及用短光脈沖照射樣品（比色皿、細(xì)胞或組織），然后隨時(shí)間測(cè)量發(fā)射強(qiáng)度。FLT由衰減曲線的斜率確定。有幾種熒光檢測(cè)方法可用于壽命測(cè)量，其中時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)收集和增強(qiáng)的定量光子計(jì)數(shù)。頻域方法涉及高頻率入射光的正弦調(diào)制。在該方法中，發(fā)射發(fā)生在與入射光相同的頻率處，并且隨著激發(fā)光兼有相位延遲和振幅的變化（解調(diào)）。壽命測(cè)量不需要波長(zhǎng)比率探針來(lái)提供眾多分析物的定量測(cè)定。壽命法通過(guò)使用光譜位移探針擴(kuò)展了分析物濃度范圍的靈敏度。壽命測(cè)量可用于沒(méi)有直接探針的分析物。包括葡萄糖、抗原或基于熒光能量轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的任何親和力或免疫測(cè)定。

熒光壽命成像或FLIM是基于熒光樣品中不同區(qū)域的熒光的指數(shù)衰減速率的差異。由τ決定熒光壽命成像的每個(gè)像素的強(qiáng)度，這使研究人員可以查看具有不同熒光衰減率的材料之間的對(duì)比度，還可以產(chǎn)生顯示其他衰減路徑變化的圖像。可以通過(guò)使用脈沖源在時(shí)域中確定熒光壽命。當(dāng)熒光物質(zhì)被超短脈沖激發(fā)時(shí)，時(shí)間分辨的熒光將呈指數(shù)衰減。時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（tcspc）通常被用作熒光壽命的測(cè)量方法，因?yàn)樗a(bǔ)償了在源強(qiáng)度和單光子的脈沖幅度的變化。更具體地說(shuō)，TCSPC由單個(gè)光子雪崩光電二極管（SPAD）記錄相對(duì)于激發(fā)激光脈沖的單個(gè)光子的壽命。重復(fù)記錄多個(gè)激光脈沖，并在記錄了足夠多的事件后，研究人員能夠建立所有這些記錄的時(shí)間點(diǎn)上事件數(shù)量的直方圖。然后，可以將該直方圖擬合到的指數(shù)壽命衰減函數(shù)的指數(shù)函數(shù)，并且可以相應(yīng)地提取壽命參數(shù)。在種類(lèi)繁多的顯微技術(shù)中，熒光壽命顯微成像技術(shù)被普遍地應(yīng)用于生物學(xué)研究及臨床診斷等領(lǐng)域。

熒光壽命成像中的熒光壽命及其含義：假定一個(gè)無(wú)限窄的脈沖光(δ函數(shù))激發(fā)n0個(gè)熒光分子到其激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子將通過(guò)輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)。假定兩種衰減躍遷速率分別為Γ和knr，則激發(fā)態(tài)衰減速率可表示為：其中n(t)表示時(shí)間t時(shí)激發(fā)態(tài)分子的數(shù)目，由此可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程。熒光壽命定義為衰減總速率的倒數(shù)：熒光強(qiáng)度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù)，因此可將上式改寫(xiě)為：其中I0是時(shí)間為零時(shí)的熒光強(qiáng)度，τ為熒光壽命。也就是說(shuō)熒光強(qiáng)度衰減到初始強(qiáng)度的1/e時(shí)所需要的時(shí)間就是該熒光物種在測(cè)定條件下的熒光壽命。實(shí)際上用熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間作圖，直線斜率即為熒光壽命倒數(shù)的負(fù)值。熒光壽命也可以理解為熒光物種在激發(fā)態(tài)的統(tǒng)計(jì)平均停留時(shí)間。事實(shí)上當(dāng)熒光物質(zhì)被激發(fā)后有些激發(fā)態(tài)分子立即返回基態(tài)，有的甚至可以延遲到5倍于熒光壽命時(shí)才返回基態(tài)，這樣就形成了實(shí)驗(yàn)測(cè)定的熒光強(qiáng)度衰減曲線。不同熒光基團(tuán)激發(fā)態(tài)停時(shí)間不同，大多數(shù)生物熒光素的熒光壽命時(shí)間在 0.2 - 20 ns。湖北紅外熒光壽命成像報(bào)價(jià)

熒光壽命成像使用簡(jiǎn)單，方便快捷，不需要進(jìn)行參數(shù)調(diào)節(jié)。湖北紅外熒光壽命成像報(bào)價(jià)

影響熒光壽命成像測(cè)量的因素有哪些？散射光的影響： 主要是瑞利散射光和拉曼散射光的影響較大。校正辦法：先用短的激發(fā)光激發(fā)，檢出溶液的拉曼峰，然后進(jìn)行熒光光譜校正。因?yàn)闊晒夤庾V不隨激發(fā)光波長(zhǎng)的改變而改變，而拉曼光卻隨之改變。高濃度樣品的影響：1）當(dāng)激發(fā)光照射高濃度樣品時(shí)，在激發(fā)光入口附近產(chǎn)生熒光，但這些熒光并不能進(jìn)入熒光檢測(cè)器。2）高濃度的分子之間相互作用而發(fā)生活性阻礙現(xiàn)象。3）熒光的再吸收：即熒光光譜的短波長(zhǎng)端和激發(fā)光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端如果相互重疊，則發(fā)生熒光再吸收。湖北紅外熒光壽命成像報(bào)價(jià)

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