2）在30-50%細(xì)胞匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通常基因沉默分析至少24-72h進(jìn)行。低密度轉(zhuǎn)染細(xì)胞可使細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分析間隔更長，從而使由于細(xì)胞過度生長造成的細(xì)胞活性過度損壞降到更低。根據(jù)靶基因的特性，高密度轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可能更加適合條件的優(yōu)惠。3）不要在轉(zhuǎn)染時的培養(yǎng)基中加入***，因為這將會將降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率和導(dǎo)致細(xì)胞死亡。4）為了獲得更好的結(jié)果，可以使用invitrogen的Opti-MEM低血清培養(yǎng)基在形成復(fù)合物前稀釋lipofectamineTM2000和siRNA。可以使用熒光標(biāo)記的siRNA幫助優(yōu)化細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件。一旦確定了用來轉(zhuǎn)染的更佳條件，可以在每一次實驗都包括熒光標(biāo)記siRNA,作為轉(zhuǎn)染效率的指示劑。本產(chǎn)品只供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床***、食品及化妝品等用途2.轉(zhuǎn)染步驟以lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA于24孔板，轉(zhuǎn)染濃度為50nM為例，其他規(guī)格容器轉(zhuǎn)染見表2。1）接種細(xì)胞：貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前24h,在400ul無***培養(yǎng)基中接種個細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度為30-50%。（注：鋪板時要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長。）懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前24h,在400ul無***培養(yǎng)基中接種個細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞數(shù)量4-8X105/孔。2）轉(zhuǎn)染步驟：A.用50ulOpti-MEM稀釋siRNA(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為50nM)。南京RNA測試公司RNA。蘇州專業(yè)做RNA提取試劑

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    輕輕吹3-5次混勻。B.輕輕混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50ulOpti-MEM稀釋lipofectamineTM2000,輕輕吹3-5次混勻，室溫下靜置5min。C.混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹3-5次混勻，室溫下靜置20min。D.轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100ul/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。E.細(xì)胞板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48h。轉(zhuǎn)染4-6h后可更換新鮮培養(yǎng)基。3）效果檢測：轉(zhuǎn)染完成后24-72h均可進(jìn)行siRNA沉默效果檢測，更佳檢測時間與細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染試劑，檢測目的等相關(guān)。1）RNA水平的檢測：mRNA是檢測siRNA沉默效率的更佳指標(biāo)，siRNA轉(zhuǎn)染后24-72h即可檢測到靶基因mRNA表達(dá)明顯降低，檢測方法是RealtimePCR。2）蛋白水平的檢測：檢測方法是Westernblot。3）功能篩選：應(yīng)用EdU細(xì)胞增殖、EdUTP細(xì)胞凋亡等方法進(jìn)行細(xì)胞功能篩選。動物實驗修飾方法：由于動物實驗對siRNA穩(wěn)定性的要求較高，盡管未修飾的siRNA也可以進(jìn)行動物實驗，但是以CHol,OMe,PS修飾的siRNA效果較好。給***法：局部給藥：更直接的導(dǎo)入方式，siRNA的導(dǎo)入效率高，用量少。siRNA能很快被吸收。適用于淺表***和組織，包括眼，肌肉和皮下組織等。2表2：使用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA產(chǎn)品參考用量細(xì)胞培養(yǎng)容器表面積。RNA測試比較好的公司有哪幾個？

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